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食品检测中分子检测技术的应用及实验室管理
发布时间:2018-12-03        浏览次数:21        返回列表

何微 岳苑 贾冰凝

摘 要:随着科学技术的发展,分子生物学检测技术已成为现代食品检测行业中的重要分支。近些年我国对食品的质量愈发重视,实时荧光定量PCR技术凭借着其高效、迅速、精准的优势已成为食品安全检测技术中的中流砥柱,进入了新阶段。本文对食品检测中实时荧光定量PCR技术的应用以及分子生物学实验室的安全隐患进行了分析与总结,提出了有效的管理对策,确保了检测环境与数据的安全。

关键词:分子生物学检测技术 实时荧光定量PCR 实验室安全

中图分类号:TS20 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2018)04(b)-0133-03

众多数据显示,实时荧光定量PCR技术由于其不可替代的优点,加之近年来各地科技攻关均把医疗卫生领域中的食品安全作为重要的优先研究领域,因此该技术被广泛应用于各类食品的微生物检测、动物源性食品掺假技术的检测以及食品的转基因状况检测等等。大量研究表明微生物与分子生物学检测技术是食品中致病菌以及掺假情况检测的基础和支撑。党的十八大之后,国家食品药品监督管理总局对食品检测领域不断进行扩项,使得各检测机构分子生物学实验室在改进检测技术,优化检测方法的同时也不断扩大实验室规模,完善检测的硬件设施,但也因此加大了分子生物学实验室管理难度。分子实验室在给我们检测提供便捷的同时,其中所包含的高毒、易燃、易爆、强氧化物质[1]也给我的检测工作带来了困扰,近期不断报道的各类生物安全事故[2],更警示着我们实验室安全不可松懈。

本文通过介绍近年来实时荧光定量PCR技术在食品检测领域的应用,并总结近年来国内外生物实验室发生的安全事故,针对具体检测情况,探究子分生物实验室所应具备的安全管理准则。

1 实时荧光定量PCR技术概括

1.1 实时荧光定量PCR技术的原理

PCR反应技术是模拟体内DNA复制的原理在体外促和成特异DNA片段的一种方法[1],实时荧光定量PCR技术则是根据所添加的荧光基团所产生的荧光信号的变化实监测每一个循环扩增产物量的变化,具体检测过程中的定量分析是根据循环阈值(Ct)和标准曲线的分析进行的。根据不同的荧光标记类型可以将RT-PCR技术分为探针类和非探针类,研究表明,探针类标记的特异性更高,应用更广。

1.2 非探针类法(荧光染色法)

众多的荧光染料中SYBR Green1由于其操作简单(无须脱色或冲洗),染色的凝胶样品荧光信号强,背景信号低,因此是应用最为广泛的。有数据表明荧光染色法至少可检出20pg DNA,这高于EB染色法的25~100倍。此外还有LC Green TM1和Pico Green等新型荧光染料,当PCR扩增的时候,所添加的染料结合到DNA上[3],则会产生荧光信号,便于研究者的有效收集。但实践证明,染料法虽然成本低,可其特异性不强,他会与所有的双链的DNA相结合,从而产生荧光,这大大降低了荧光染色法的检测精度[4]。

1.3 荧光探针法

探针法则避开了荧光染色法的不足,在对模板进行扩增时,除引物外再添加一个特异性的探针,此探针的两端具有发光和淬灭两个基团,当DNA通过引物进行合成的时,探针折断,其两端的基团均被释放,此时实时荧光定量PCR仪通过收集发光基团产生荧光,从而对检测基因进行定量[5]。目前食品检测过程中应用最多的为TaqMan探针技术[6],在扩增过程中,每一次模板的复制就伴随着一个探针的断裂,并同时释放一个荧光信号,随着产物的增加,荧光信号也跟着不断加强,将不同的模板扩增的Ct值和标准模板数的对数值拟合成标准曲线,从而准确推斷出起始模板的数量。

除此之外,我们还有ScorpionsTM/AmplifluorTM (杂交探针)、LUX(杂交探针)、Universal probe library-LNA ( locked nucleic acids水解探针)、Simple probe探针、Dual-oligo FRET pairs(双杂交探针)等探针技术[7]。

1.4 实时荧光定量PCR法在食品检测方面的应用

实时荧光PCR 技术有效减少扩增产物的交叉污染[8],加之其可以直接定量,查看浓度,这就避免了传统PCR检测时所需的电泳及相关色剂对检测人员造成伤害。因此该检测方法被广泛应用在对食品中的致病菌进行检测的环节中[9],相比较传统的按部就班的微生物检测办法,实时荧光定量PCR法更为快速、敏感[10]。

转基因食品近年发展十分迅速,但其所产生的食品安全性问题也成为公众关注的焦点,随着人们食品安全需求的日益增加,目前对食品转基因检测已从定性提高到定量水平。当前对转基因食品检测技术路线主要有两条:一是对外源基因表达产物蛋白质进行检测;二是直接检测外源基因DNA。与此同时,荧光定量PCR技术还可应用于食品中掺假问题的检查。

以上种种表明,实时荧光定量PCR技术在检验过程中必不可少,因此为了保障工作的顺利开展,我们不仅要熟练掌握分子检测技术,更应保障分子实验室的安全。

2 分子实验室的安全

2.1 分子实验室安全隐患分析

根据国内外分子生物学实验室安全事故的报道[11],本文将分子安全隐患主要归结为以下几个方面。

2.1.1 实验危险试剂及检验废弃物

日常食品的微生物和分子生物学检验过程中因为涉及到均质、稀释、培养、扩增等步骤,因此常常会产生一些废液、培养物及固体废弃物等,其中很多废弃物具有生物安全隐患[12];其尤其是利用实时荧光定量PCR技术对食品中的微生物进行快速检测时,很容易造成各类致病菌及组织样品的污染,这类污染物具有一定的传染性,倘若处理不当会不仅会造成检验室的污染,影响今后的检测结果;更会对实验人员的身体健康造成伤害。另外检测中所用部分生物试剂也会对检验员造成潜在的危害,如若细胞裂解液、各类酶、溴化乙锭染色液以及各类模板及其所对应的引物和探针等具有一定的致癌性和毒性[13]。

2.1.2 易造成事故的仪器设备

食品检测分子生物学实验室中有很多专用检验设备,较为常见的有高压灭菌锅、干热加热器、均质器、液氮钢瓶、高速冷冻离心机、PCR仪等设备[14],具体操作时必须严格按照规定要求进行使用,否则会造成严重的后果。此外,某些大功率仪器设备使用时发生故障,有可能会引起电力故障甚至火灾,尤其是高压灭菌锅,使用时轻则烫伤,重则爆炸;因此一定要注意防护。

为了确保日常检测工作的顺利开展我们一定要做到防患于未然,不仅需要注意荧光定量PCR等大型仪器的期间核查和校准,还需要注意实验室安全维护。

3 食品检测分子生物学实验室的管理

3.1 分子实验室的功能区域的设立及相应的卫生管理措施

根据各单位具体的检测需要,食品检测分子生物学科研实验室可以划分为RNA(DNA)提取专区、体系配置及核酸浓度检查区、PCR扩增区、电泳区、灭菌区等区域。各区域之间通过传递窗传递物品,传递窗中安装紫外灯,做好了隔离措施,从以确保降低实验室污染、减少安全事故的发生。

此外在实验室日常管理中,严格实行专人专责,注意日常检测工作中仪器的期间核查、维护保养、水电安全、卫生消毒效果等的监测,对于大型仪器及危险系数较高的仪器,如高压灭菌锅,实时荧光定量PCR仪等使用前必须安排人员进行学习,考核合格后方可上岗,并定期做好检验人员的持续能力评价工作。

3.2 严格加强生物试剂的管理

食品检测过程中所需使用的生物试剂的管理是每个检测机构中分子生物实验室管理的重要部分,特别是危险试剂的管理。因此必须从试剂的购买申请、采购、验收、储存、管理、使用、无害化处理等全过程加强规范管理[15]。对于剧毒试剂(如EB染料)、易燃(如酒精)、易爆品(如液氮等)以及试验所需标准菌株的购买均得交单位审批后方可购买。在实验室中,各类试剂及培养基均需做好严格的分类摆放,对于标准菌株的管理需严格实行双人双锁管理制度,并要求填写领用登记单,以及相关入库表。

3.3 生物废弃物管理

对于分子实验过程中所产生废弃物(如帽子、口罩、手套、枪头、DNA提取物、扩增产物等),严格按照操作流程实行,绝不随意放置,分子检测实验室应规定明显的实验废弃物回收点,严禁把实验废弃物和普通生活垃圾混放,对于产生的废弃物必须进行无害化处理后才能倾倒或填埋,及时做好污染物处理记录,并且定期采用生物(化学)监测检测灭菌及无害化处理效果。

4 未来展望

近几年来,各地的分子生物学实验室数量呈逐年增加的趋势,而有关采用实时荧光定量PCR技术对食品进行快速检测的地方标准也层不不穷,与此同时,随着分子生物学技术更为广泛的被应用,检验过程中的易制毒化学品的使用数量亦在不断增加,因此迫切需要各单位对易制毒化学品进行规范管理,并在管理方式上进行创新;在提升检测技术,优化检测方法的同时,也要多借鉴他人的成功之处,在此基础上,形成本单位更为有效的分子实验室安全规范管理体系,使得检测和管理每一个环节无懈可击。通过单位各部门的充分合作,确保检测工作更顺利的开展 。

参考文献

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